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人BRAF基因V600E突变检测试剂盒(荧光PCR法)-冻干

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所属分类:药物基因个性化检测

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人BRAF基因V600E突变检测试剂盒(荧光PCR法)-冻干

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产品简介

产品名称  BRAF基因V600E突变检测试剂盒(荧光PCR法)

包装规格  24人份/盒、48人份/

预期用途

本检测试剂盒用于体外定性检测人类黑色素瘤、大肠癌、甲状腺癌和肺癌石蜡包埋组织样本中BRAF基因V600E突变。

BRAF基因编码的蛋白质是存在于细胞质内的丝氨酸/苏氨酸特异性蛋白激酶,是RAS/RAF/MEK/ERK/MAPK通路中重要的信号调节因子参与调控细胞内多种生物学活动,如细胞生长、分化和凋亡等[1]。已发现有超过30BRAF突变类型,其中约有90%的突变位于第15外显子,其中V600E突变被认为是最常见的突变,即第15外显子中第1799位核苷酸胸腺嘧啶(T)突变为腺嘌呤(A),导致蛋白质产物中第600位的缬氨酸(V)被谷氨酸(E)替代[2-3]。这种V600E突变导致BRAF的激酶活性增加,从而持续激活下游MAPK信号通路,引起肿瘤细胞的过度增殖和恶性转化。

BRAF突变常见于黑色素瘤、结直肠癌、甲状腺癌及肺癌等恶性肿瘤中。研究认为BRAF基因突变与EGFRKRAS等突变相互独立、相互排斥且不同时出现[4] 美国国立综合癌症网络(NCCN)《结直肠癌临床实践指南》(V3.2011)建议,转移性结直肠癌患者在使用EGFR抑制剂-爱必妥或帕尼单抗等靶向药物治疗时,应该进行肿瘤组织KRAS基因突变检测,如果KRAS无突变,应该考虑检测BRAF基因状态,患者存在V600E突变时,对EGFR单抗药物是无效的。因此了解BRAF基因的突变情况,成为临床靶向药物治疗中筛选EGFR酪氨酸激酶抑制剂(EGFR-TKIs)BRAF基因突变靶向药物受益患者的需要。

本试剂盒仅用于对BRAF基因V600E(即1799T>A)体细胞突变进行检测。,其检测结果仅供临床参考,不应作为患者个体化治疗的唯一依据,临床医生应结合患者病情、药物适应症、治疗反应及其他实验室检测指标等因素对检测结果进行综合判断。

 检验原理

本检测试剂盒采用PCR富集液、ARMSAmplification refractory mutation system)技术与Taqman探针相结合方法检测BRAF基因V600E突变。Taqman探针分别标记一个报告荧光基团FAM和一个淬灭荧光基团BHQ1。探针完整时,报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收;PCR扩增时,Taq酶的5’3’的外切酶活性将探针酶切降解,使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离,从而荧光监测系统可接收到荧光信号。PCR富集液通过酶切作用,降低了野生型背景序列,进一步提高了检测的分辨率、灵敏度。ARMS方法的特点通过无3’-5’外切酶活性的Taq DNA Polymerase,可特异性的识别引物的3’末端,只有引物3’末端完全配对时,才能正常扩增发生突变位点的片段,当引物3’末端发生错配时,不能有效的扩增。因此,采用此种方法可选择性的扩增突变序列,Taqman探针与扩增产物结合,从而鉴定出突变目的序列。

内参反应液作为对试剂、DNA质量以及操作本身的质控,即便DNA有降解,通过内参能够真实地反应体系中基因有效的DNA 量。

检测体系中含有一定比例的dUTPdNTP和尿嘧啶DNA糖基化酶(UDG酶),这种酶(也称为尿嘧啶-N-糖基化酶或UNG酶)可以打断含有dUTPPCR产物,从而有效的防止PCR污染。

储存条件及有效期

  1. 未开封的试剂盒:应在避光、温度不高于30下储存,有效期12个月。
  2. 撕开密封袋后,管内的冻干试剂应立即使用。
  3. 冻干的核酸反应液复溶后立即进行RT-PCR检测,否则应避光储存于-15℃以下,有效期为1周,避免反复冻融(应限制在2次以内)。
  4. 冻干的阳性对照复溶后,应储存于-15℃以下,有效期为1周,避免反复冻融(应限制在2次以内)。
  5. 运输条件:低于37可稳定运输1个月。
  6. 生产日期、生产批号及失效日期见包装标签。

适用仪器

ABI7500荧光定量PCRABI7300荧光定量PCR仪、QuantStudio®5实时荧光定量PCR系统LightCycler® 480荧光定量PCR系统、、伯乐BioRad CFX96实时荧光定量PCR

样本要求

石蜡包埋病理组织或切片样品应确定含有肿瘤病变细胞,所取部分尽量在蜡块中部,石蜡切片数应不少于3张,厚度在5~10μm。且手术切除的组织应尽快在4~10%的福尔马林中固定,固定时间以8~24 小时为宜;包埋前应进行彻底脱水。所用石蜡包埋病理组织或切片样品一般请选择保存尚未超过3年的样品。

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